三分钟带你了解当前最热的基因编辑技术

三分钟带你了解当前最热的基因编辑技术

　　基因编辑技术指能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。基因编辑是一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知的序列，通过改变生物的遗传基因，使其特定的基因功能丧失作用，通过研究对生物体造成的影响，进而推测出该基因的生物学功能。本文为你科普基因编辑三大技术：

　　基因敲除

　　进行DNA水平编辑。一般用于构建基因敲除鼠模型。

　　CRISPR/Cas9：CRISPR/Cas9系统作为细菌和古细菌的获得性免疫系统，通过RNA介导特异性的切割外源遗传物质，用以对抗入侵的病毒和质粒。使用Cas9切口酶和一对sgRNA，两个相近的切口造成DNA双链断裂，诱导细胞发生非同源末端连接修复，造成目的基因的突变。

　　CRISPR/Cas9技术自问世以来，取代“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN），成为科研、医疗等领域的有效工具”.一般通过体外转录得到sgRNA与cas9的mRNA，通过注射到原核期受精卵内，移植到假孕母鼠体内获得基因编辑的小鼠进行基因功能研究。

　　构建方法：

　　确定待敲除基因的靶位点。

　　设计识别靶位点的识别的一对sgRNA。

　　构建可表达sgRNA的Cas9质粒。

　　体外转录sgRNA 和Cas9 RNA。

　　将sgRNA和Cas9 RNA直接注射入受精卵检测sgRNA活性。

　　将有活性的sgRNA和Cas9 RNA直接注射入受精卵建立Founder。

　　将Founder自交得到F1代。

　　适用范围：

　　制备敲除鼠，利用敲除鼠进行基因功能的研究；进行细胞水平敲除基因时，可以选择慢病毒载体，构建lenticrispr-v2质粒，通过包装病毒进行细胞水平敲除。

　　基因敲减

　　RNA水平，是指通过降解具有同源序列靶基因的mRNA，达到阻止基因表达的作用。一般用于细胞水平敲减基因。

　　（1）RNA干扰：

　　是siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物RISC。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默，是一种特异性的转录后基因沉默。

　　一般合成针对靶基因的siRNA，通过转染的方法使之进入细胞内，使靶基因沉默。这一方法受转染效率的影响较大。目前有不少基因的siRNA已经有商业产品，所以使用时买来就可以了，比较方便。

　　适用范围：

　　一般通过公司合成后，通过转染细胞进行细胞水平敲减。

　　（2）shRNA：

　　“短发夹RNA”，shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop）序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制。随后再连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。

　　构建shRNA的病毒表达载体，常用的病毒载体有腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体等，机制与质粒载体相似，利用了病毒感染细胞效率比较高的特点，解决了用质粒载体转染效率低的缺陷。

　　构建方法：

　　shRNA设计：设计RNA干扰序列是RNAi实验的关键。

　　载体构建：可根据实验需求选择慢病毒、腺病毒载体。

　　转染细胞：常用的方法包括磷酸钙转染、脂质体转染、电穿孔转染等

　　观测GFP 荧光和稳定表达细胞系筛选：可用于带有GFP标签的质粒载体。

　　检测RNA 干扰效率：可以在蛋白水平或mRNA水平检测RNA干扰效率。

　　适用范围：

　　一般通过构建慢病毒、腺病毒等进行细胞水平敲减。

　　编辑点评

　　在过去几年中， 以ZFN和TALEN为代表的序列特异性核酸酶技术以其能够高效率地进行定点基因组编辑， 在基础研究、基因治疗和遗传改良等方面展示出了巨大的潜力。而CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。

（原标题：基因编辑那么热，可是你都会用了吗？）

（来源：解螺旋）

文章链接：中国化工仪器网 http://www.chem17.com/news/detail/110946.html